Пролиферативная активность клеток отражает интенсивность роста опухолей. В статье приведены данные изучения уровня пролиферации клеток базалиомы — наиболее частой злокачественной опухоли кожи. Исследование проводили иммуногистохимическим методом с маркером пролиферации Ki67. По характеру пролиферации базалиома представляла гетерогенную группу. Солидный, аденоидный, поверхностный мультицентрический тип базалиомы отличались низкой пролиферативной активностью с преимущественным распределением клеток, экспрессирующих Ki67, по периферии комплексов. Высокую пролиферативную активность выявляли в инфильтративном, склерозирующем и микронодулярном типе при равномерном распределении пролиферирующих клеток.

Пролиферативная активность клеток отражает интенсивность роста опухолей. В статье приведены данные изучения уровня пролиферации клеток базалиомы — наиболее частой злокачественной опухоли кожи. Исследование проводили иммуногистохимическим методом с маркером пролиферации Ki67. По характеру пролиферации базалиома представляла гетерогенную группу. Солидный, аденоидный, поверхностный мультицентрический тип базалиомы отличались низкой пролиферативной активностью с преимущественным распределением клеток, экспрессирующих Ki67, по периферии комплексов. Высокую пролиферативную активность выявляли в инфильтративном, склерозирующем и микронодулярном типе при равномерном распределении пролиферирующих клеток.

Введение

В структуре злокачественных эпителиальных опухолей кожи первое место занимает базалиома, на долю которой приходится от 75 до 94% [1, 2]. В подавляющем большинстве случаев регистрируются солитарные опухоли, локализующиеся на открытых участках кожи, подверженных инсоляции. Опухоль отличается медленным  течением и относительно благоприятным прогнозом. Однако в ряде случав она может значительно увеличиваться в размере, характеризуясь выраженным экзофитным ростом, либо приобретать инвазивные черты, проникая в окружающие и подлежащие ткани, приводя к их разрушению. Подобный  рост опухоли обычно ассоциируется с определенными морфологическими типами, которые рассматривают как агрессивные [3].

Показателем интенсивности роста ткани является пролиферативная активность клеток. Она относительно спокойна в доброкачественных процессах и резко возрастает в злокачественных опухолях. Аналогичные тенденции присущи и эпителиальным опухолям кожи. Так, пролиферативная активность клеток базальноклеточного рака кожи выше, чем в очагах лейкоплакии [4], а  при раке in situ  индекс пролиферации превосходит  таковой при предраковом актиническом кератозе [4,5]. Плоскоклеточный рак кожи отличается высоким уровнем пролиферации, который следует за снижением степени его дифференцировки  [6, 7, 8].

Предыдущие исследования показали, что по характеру пролиферативной активности клеток базалиома представляет гетерогенную группу. Наиболее интенсивный рост имела язвенная форма, тогда как нодулярная и поверхностная характеризовались умеренными и низкими показателями [9]. Высокий уровень пролиферации отмечали в микронодулярном, метатипическом  типе базалиомы и типе морфеа [10, 12]. Также отмечали повышение индекса Ki67 в инфильтративном и метатипическом типе по сравнению с нодулярным и поверхностным [11, 13]. В то же время единого мнения о связи уровня пролиферации с гистологическим типом базалиомы до сих пор нет, так как другие исследования свидетельствовали, что индекс  Ki67 в нодулярном и поверхностном мультицентрическом типе базальноклеточного рака значительно превосходил аналогичный показатель в склерозированном и типе морфеа [14, 15]. Учитывая противоречивые данные, представляется интересным и актуальным продолжить изучение пролиферативной активности клеток в различных морфологических типах базалиомы, что позволит более детально понимать маркеры и предикторы агрессивного течения опухоли. 

Материалы и методы

В работе исследования использовали 36 биоптатов кожи больных базальноклеточным раком кожи. Биопсию кожи размером 0,5 х 0,5 см  проводили под местной анестезией 2% раствором новокаина, биоптаты фиксировали в 10% растворе формалина, забуфференом по Лилли при рН-7,4. Материал заливали в парафин по обычной методике. Серийные срезы толщиной 3–5 мкм депарафинировали по стандартной схеме, затем окрашивали гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическое исследование проводили в соответствии со стандартным протоколом. Парафиновые срезы наносили на стекла с адгезивным покрытием, депарафинировали по стандартному протоколу. Срезы, погруженные в цитратный буфер, инкубировали в микроволновой печи при мощности 690 Вт два раза по пять минут.  Двадцать минут при комнатной температуре, срезы охлаждали, подсушивали и наносили первичные антитела. Для определения уровня пролиферации использовали моноклональные антитела к протеину Ki67 (DAKO), разведение 1:200. Использовались соответствующие позитивные и негативные контроли – иммунные и неиммунные сыворотки. Срезы промывали в буфере, подсушивали, затем на них наносили EnVision (anti-mouse и anti-rabbit, фирмы DAKO, Дания) на 30–40 минут. Для визуализации реакции наносили DAB+ (3, 3^ґ–диаминобензидин), что позволяло получать специфическую коричневую окраску. Затем срезы докрашивали гематоксилином Майера.  Определение уровня пролиферации оценивалась с помощью индекса, который вычислялся как среднее от числа меченных ядер на 100 учтенных ядер (при учете 500–1000 опухолевых клеток). Подсчет меченных ядер проводился в репрезентативных полях зрения с относительно равномерным распределением опухолевых клеток, сверху вниз и слева направо. Клетки на периферии срезов, где чаще всего наблюдается фоновое окрашивание, не учитывались. 

Для статистической обработки данных использовались методы t-Стьюдента с поправкой для множественных сравнений; хи-квадрат. Расчеты проводились при помощи программы BIOSTAT. Полученные различия считались достоверными при значениях p ? 0,05. 

Результаты

Среди 36 базалиом пять имели поверхностный мультицентрический тип строения, четыре – поверхностный мультицентрический в сочетании с солидным, семь – солидный, два – аденоидный, два – солидно-аденоидный, пять – инфильтративный, три – микронодулярный. В восьми случаях отмечали различные варианты сочетания солидного, инфильтративного, микронодулярного, склерозирующего строения.

Индекс пролиферации Ki67 в поверхностном мультицентрическом типе и при сочетании его с солидным компонентом варьировал от 14,9 до 31,1%. Средний индекс составлял 22,2%. Пролиферирующие клетки в шести случаях располагались преимущественно по периферии клеточных комплексов, в трех – равномерно по клеточным комплексам. При солидных опухолях средний индекс составил 26,5%, он варьировал от 14,5 до 38,2% (рис.1). Периферическое распределение наблюдали в четырех случаях, равномерное – в трех.  При аденоидном строении пролиферирующие клетки распределялись равномерно, индекс пролиферации составлял 22,6 и 31,3%.  В случаях, когда имелось сочетание солидного и аденоидного компонентов, индекс пролиферации составлял 36,8 и 19,2%, В первом случае клетки распределялись равномерно, во втором – равномерно в аденоидном компоненте и по периферии – в солидном. В опухолях инфильтративного, микронодулярного  строения и при их сочетании клетки, экспрессирующие маркер Ki67, диффузно регистрировались по всем клеточным комплексам. В инфильтративном типе минимальное и максимальное значение индекса было 27,6 и  47,8% (среднее значение – 35,4%) (рис.2).  Микронодулярные базалиомы имели средний индекс Ki67 26,9%.  В случаях инфильтративно-склерозирующего строения индекс имел значение 40,2 и  31,6%, пролиферирующие клетки равномерно распределялись в комплексах (рис.3). При сочетании инфильтративного, солидного и микронодулярного строения преимущественно отмечали равномерное распределение пролиферирующих клеток, и средний индекс составлял 36,5% (значения варьировали от 22,1 до 50,4%). Солидное строение в сочетании с инфильтративным склерозирующим имели опухли с индексом Ki67  26,7 и 35,3%, в солидном компоненте пролиферирующие клетки располагались преимущественно по периферии  комплексов, инфильтративном склерозирующем – равномерно.

При анализе пролиферативной активности клеток мы сгруппировали опухоли в зависимости от характера течения и  роста. В группу неинвазивного роста мы включили опухоли, имеющие поверхностный мультицентрический, солидный, аденоидный, сочетание поверхностного мультицентрического и солидного компонентов. В группу с инвазивным ростом нами были включены опухоли  инфильтративные, микронодулярные, инфильтративно склерозирующие, а также опухоли сложного строения (инфильтративный + микронодулярный + солидный и солидый + инфильтративный склерозирующий).

Средний индекс пролиферации неагрессивных типов составил 24,77 ± 7, 47 с доверительным интервалом 95% 21,27–28,26 (табл. 1). Средний индекс Ki67 агрессивных типов составлял 33,53 ± 8,94 с доверительным интервалом 95% 28,77–38,29 (табл. 1). Различия в уровне пролиферации между агрессивными и неагрессивными типами носили статистически значимый характер  (р = 0,003). Анализ характера распределения пролиферирующих клеток в опухолевых комплексах показал, что в неагрессивных типах периферическое распределение клеток наблюдалось в 50% случаев, равномерное – в 45%, в 5% случаев ряд комплексов в опухоли имели один тип распределения, другие комплексы – иной тип распределения (табл.2). В агрессивных типах 81,25% случаев имели равномерное распределение пролиферирующих клеток, сочетание двух типов распределения – 18,75% (табл. 2). Периферическое распределение пролиферирующих клеток в агрессивных типах не встречалось.  При сравнении распределения клеток между агрессивными и неагрессивными типами опухоли было показано, что различия носят статистически достоверный характер    (р = 0,003). 

 Таблица 1. Индекс пролиферации Ki67 в агрессивных и неагрессивных морфологических типах базалиомы

Различия статистически значимы, значение p = 0,003 (t-критерий Стьюдента) 

Таблица 2. Распределение клеток в комплексах базалиомы

Различия статистически значимы, значение p = 0,003 (критерий Хи-квадрат) 

Обсуждение

При изучении пролиферативной активности клеток было показано, что поверхностный мультицентрический, солидный, аденоидный тип базалиомы, а также их сочетания характеризуются относитеьно невысоким средним индексом Ki67, который варьировал в пределах 22,2–26,5%. Ранее было показано, что  опухоли солидного, солидно-аденоидного, солидно-инфильтративного и аденоидного строения имели средний индекс Ki67 15,02 ± 4,91% при разбросе показателей от 8,6 до 32,1% [12]. В нашем исследовании опухоли инфильтративного, инфильтративно-склерозирующего строения имели более высокий индекс Ki67 35,4 и 38,4% соответственно. Схожие показатели имели сложные базалиомы, сочетающие в своем строении инфильтративный, солидный, микронодулярный и склерозирующий компоненты. Значительное повышение уровня пролиферации в инфильтративном и метатипическом типе, по сравнению с поверхностным мультицентрическим и нодулярным, отмечали и другие исследователи [11, 13]. Седова Т. Г. показала, что опухоли, имеющие морфеа строение в 70% случаев имели высокую пролиферативную активность клеток [10]. Значительное повышение пролиферативной активности клеток до 87,5 ± 2,5% наблюдали и при метатипическом типе базалиомы, по сравнению с другим морфологическим строением [9]. Однако, по нашим данным, статистически достоверных различий пролиферативной активности клеток между отдельными типами базалиомы установлено не было.  Возможно, это объясняется незначительным количеством отдельно взятых типов. Поэтому  опухоли были объединены в зависимости от характера течения и  роста на две группы: неагрессивного и агрессивного роста. Средний индекс Ki67 составил в группах 24,77 ± 7,47  и 33,53 ± 8,94  соответственно. Различия в уровне пролиферации между агрессивными и неагрессивными типами носили статистически значимый характер  (р = 0,003).

Нет определенной ясности относительно микронодулярного типа базалиомы. По нашим данным, он имел индекс пролиферации 26,9%, что соответствовало показателям солидного, аденоидного и поверхностного мультицентрического типа. Хотя ранее отмечали превосходство в 1,5 раза  уровня пролиферации микронодулярного типа над солидным и аденоидным [12].

Установлена ассоциация между индексом Ki67 и распределением пролиферирующих клеток в клеточных комплексах базалиомы. В агрессивных типах, характеризующихся более высоким уровнем пролиферации, клетки, экспрессирующие Ki67, локализуются равномерно в клеточных комплексах. Тогда как в неагрессивных в половине случаев пролиферирующие клетки распределяются по периферии. Преимущественно периферическое распределение отмечали в поверхностных базалиомах по сравнению с язвенными, а также в первичных, по сравнению с рецидивными [16], что также ассоциировалось с более низким пролиферативным потенциалом.

Заключение      

• По уровню пролиферативной активности клеток базалиома представляет гетерогенную группу. 

• Средний индекс пролиферации неагрессивных типов (солидного, аденоидного, поверхностного мультицентрического и их сочетаний)  составил 24,77 ± 7,47 с доверительным интервалом 95% 21,27–28,26. Средний индекс Ki67 агрессивных типов (инфильтративного, микронодулярного, инфильтративного склерозирующего и их сочетания с солидным компонентом) составлял 33,53 ± 8,94 с доверительным интервалом 95% 28,77–38,29. Различия в уровне пролиферации между агрессивными и неагрессивными типами носили статистически значимый характер  (р = 0,003).

• Клетки, экспрессирующие Ki67, распределяются в клеточных комплексах базалиомы равномерно и по периферии. В неагрессивных типах периферическое распределение клеток наблюдалось в 50% случаев, равномерное – в 45%. В агрессивных типах 81,25% случаев имели равномерное распределение пролиферирующих клеток, сочетание двух типов распределения – 18,75%. Различия в распределении клеток, экспрессирующих  Ki67,   между агрессивными и неагрессивными типами базалиомы носят статистически достоверный характер    (р = 0,003). 

Литература

Birch-Johansen F., Jensen A., Mortensen L., Olesen A. B., Kjaer S. K. Trends in the incidence of nonmelanoma skin cancer in Denmark 1978–2007: Rapid incidence increase among young Danish women. Int. J. Cancer 2010, 127, 2190–2198.

Lomas A., Leonardi-Bee J., Bath-Hextall F. A systematic review of worldwide incidence of nonmelanoma skin cancer. Br. J. Dermatol. 2012, 166, 1069–1080.

Mamata M., Karuna R. Basal cell carcinoma: evaluation of clinical and histologic variables. Indian Journal of Dermatology. 2004; 49: 25–27.

Talghini S., Halimi M., Baybordi H. Expression of p 27, Ki 67, p 53  in squamous cell carcinoma, actinic keratosis and  Bowen disease. Pakistan Journal of Biological Sciences 2009, 12 (12): 929–933.

Çayirli M., Köse O., Demiriz M. Clinical, dermoscopic and immunohistochemical assessment of actinic keratoses and evaluation of the effectiveness of diclofenac therapy with immunohistochemical analysis. Arch Dermatol Res. 2013; 305: 389–395.

Scola N., Segert H. M., Stücker M., Altmeyer P., Gambichler T., Kreuter A. Ki-67 may be useful in differentiating between keratoacanthoma and cutaneous squamous cell carcinoma. Clin. Exp. Dermatol. 2014; 39: 216–218.

Lan Y. J., Chen H., Chen J. Q., Lei Q. H., Zheng M., Shao Z. R. Immunolocalization of vimentin, keratin 17, Ki-67, involucrin, β-catenin and E-cadherin in cutaneous squamous cell carcinoma. Pathol. Oncol. Res. 2014; 20: 263–266.

Sánchez-Hernández M., Conesa-Zamora P., García-Solano J., Corbalán-Vélez R., Martínez-Barba E., Pérez-Guillermo M. Expression profiles of ProEx C and Ki67 in squamous cell carcinoma in situ of the skin and their relationship with human papillomavirus genotypes. J. Cutan Pathol. 2010; 37: 730–736.

Снарская Е. С. Иммунологические аспекты патогенеза, дифференциальной диагностики и иммунотерапии язвенной разновидности базальноклеточного и метатипического рака кожи. Дисс. Докт. мед. наук, М., 2005.

Седова Т. Г. Базальноклеточный рак кожи (эпидемиология, клинико-морфологические особенности, оценка факторов риска). Дисс. Канд. мед. наук, М., 2009.

Kramer E., Herman O., Frand J., Leibou L., Schreiber L., Vaknine H. Ki67 as a biologic marker of basal cell carcinoma: a retrospective study. Isr. Med. Assoc. J. 2014; 16: 229–232.

Алиева П. М. Совершенствование аппликационной терапии солитарной нодулярной базалиомы. Автореф. Дисс. Канд. мед. наук. М., 2014.

Bieniek A., Pula B., Piotrowska A., Podhorska-Okolow M., Salwa A., Koziol M., Dziegiel P. Expression of metallothionein I/II and Ki-67 antigen in various histological types of basal cell carcinoma. Folia Histochem. Cytobiol. 2012; 50: 352–357.

Mateoiu C., Pirici A., Bogdan F. Immunohistochemical nuclear staining for p53, PCNA, Ki-67 and bcl-2 in different histologic variants of basal cell carcinoma. Rom. J. Morphol. Embryol. 2011; 52 (1 Suppl): 315–319.

Corrêa Mde P., Ferreira A. P., Gollner A. M., Rodrigues M. F., Guerra M. C. Markers expression of cell proliferation and apoptosis in basal cell carcinoma. An. Bras. Dermatol. 2009; 84: 606–614.

Kazantseva I. A., Khlebnikova A. N., Babaev V. R. Immunohistochemical study of primary, recurrent and metatypical basal cell carcinoma.  Am. J. Dermatopathol. 1996; 18: 35–42. 

Рисунок 1. Экспрессия Ki67 в солидной базалиоме. Низкий индекс пролиферации. Распределение клеток, экспрессирующих Ki67 по периферии комплексов. Иммуногистохимическая реакция. ПАП-метод, докраска ядер гематоксилином Майера. Ув. Х200

Рисунок 2. Экспрессия Ki67 в  базалиоме инфильтративного строения. Средний индекс пролиферации. Равномерное распределение клеток, экспрессирующих Ki67. Иммуногистохимическая реакция. ПАП-метод, докраска ядер гематоксилином Майера. Ув. Х200

Рисунок 3. Экспрессия Ki67 в инфильтративно-склерозирующей базалиоме. Высокий индекс пролиферации. Равномерное распределение клеток, экспрессирующих Ki67. Иммуногистохимическая реакция. ПАП-метод, докраска ядер гематоксилином Майера. Ув. х400