Введение

Нейроэндокринные опухоли (НЭО) легкого представляют собой гетерогенную группу новообразований, включающую типичный карциноид, атипичный карциноид, крупноклеточную нейроэндокринную карциному и мелкоклеточную нейроэндокринную карциному. При этом НЭО легкого являются сравнительно редкими опухолями с вариабельным биологическим поведением и неоднозначным прогнозом [1, 2]. Несмотря на четко определенные морфологические критерии, основанные на митотической активности и наличии очагов некроза, одной только рутинной гистологической оценки нередко недостаточно для более точной стратификации злокачественного потенциала этих новообразований [1, 3].

В силу этих причин особый интерес представляет изучение дополнительных иммуногистохимических маркеров, способных дополнить морфологическую характеристику НЭО легкого. Индекс пролиферативной активности Ki-67 является одним из наиболее обсуждаемых показателей в диагностике и прогностической оценке легочных нейроэндокринных новообразований, демонстрирующий долю клеток, находящихся в активных фазах клеточного цикла, и тем самым служит суррогатным маркером опухолевой пролиферации [1, 4]. Хотя Ki-67 не включен в число обязательных критериев для гистологического разделения типичного и атипичного карциноидов легкого в современной классификации, его практическая значимость в спорных случаях оценки риска более агрессивного течения продолжает активно обсуждаться [1, 4, 5].

Одновременно с этим имеется потребность в исследовании маркеров, отражающих другие стороны биологии опухолей – сигнальную трансдукцию, межклеточную адгезию и регуляцию апоптоза. В этом контексте особый интерес представляют белки ROS1, CEA и BCL2, анализ которых в сопоставлении с индексом Ki-67 может дать более целостное представление о функциональном профиле НЭО легкого [2, 3].

Белок ROS1 – рецепторная тирозинкиназа семейства инсулиновых рецепторов, участвующая в регуляции сигнальных путей, которые контролируют клеточный рост, выживание клеток, их дифференцировку и процессы опухолевой трансформации [6, 7]. Наибольшее применение в клинической практике маркер ROS1 получил при диагностике немелкоклеточного рака легкого, в котором перестройки гена ROS1 рассматриваются как терапевтически значимые драйверные события, а иммуногистохимическое выявление белка используется в качестве скрининга для молекулярного тестирования [6, 8]. В контексте карциноидов легкого данные о распределении этого белка существенно ограничены, что само по себе подчеркивает актуальность изучения этого маркера в данной группе опухолей.

Современные обзоры молекулярной биологии НЭО легкого указывают на необходимость дальнейшего расширения панели биомаркеров за пределами стандартных нейроэндокринных антител [2, 9]. Следовательно, иммуногистохимическое определение белка ROS1 в карциноидах легкого, вероятно, имеет значение как для характеристики их молекулярной гетерогенности, так и для обсуждения потенциальных параллелей с другими опухолями легкого, в которых этот рецептор уже имеет диагностическую и терапевтическую значимость [2, 6].

Карциноэмбриональный антиген (CEA, CEACAM5) – гликопротеин семейства молекул клеточной адгезии, который в онкопатологии традиционно связывают с нарушением межклеточных взаимодействий, усилением инвазивного потенциала и прогрессией опухоли [2, 10]. CEA может выявляться в первичных карциноидных опухолях легкого, что ассоциировалось с более агрессивным течением и наличием метастазов [10, 11]. Также в исследовании, в ряде резецированных легочных карциноидов синтез белка CEA был специально оценен иммуногистохимически, хотя независимой прогностической значимости продемонстрировано не было [11]. Таким образом, CEA в карциноидах легкого остается маркером с неоднозначной клинически интерпретацией, а его сопоставление с уровнем пролиферативной активности, вероятно, поможет уточнить, связан ли фенотип адгезии и эпителиальной дифференцировки с уровнем пролиферативной активности [3, 11].

BCL2 является антиапоптотическим белком митохондриального пути, обеспечивающим выживание клеток за счет подавления программируемой клеточной гибели [12]. Для спектра легочных НЭО показано, что синтез BCL2 и усиление связанных с ним антиапоптотических механизмов возрастают по мере перехода к более злокачественным вариантам, тогда как карциноиды в целом характеризуются более низкими уровнями экспрессии по сравнению с мелкоклеточным и крупноклеточным нейроэндокринным раком [12, 13]. Вместе с тем карциноиды были включены в сравнительные исследования легочных НЭО, посвященные апоптозу и пролиферации, где обсуждалась связь между BCL2-зависимым антиапоптотическим фенотипом и степенью злокачественности [13]. Поэтому анализ BCL2 именно в карциноидах легкого, особенно в сопоставлении с Ki-67, позволит оценить баланс между клеточной пролиферацией и способностью опухоли избегать апоптоза [3, 12, 13].

Актуальность изучения карциноидов легкого определяется их редкостью, морфологической и клинической неоднородностью, а также ограниченностью валидированных тканевых прогностических маркеров для повседневной патоморфологической практики [2, 5]. Даже в пределах одной морфологической категории эти опухоли могут демонстрировать различия в темпах роста, вероятности метастазирования и клиническом исходе, что делает поиск дополнительных биомаркеров особенно важным [2, 3].

В этом контексте исследование распределения ROS1, CEA и BCL2 в соотношении с индексом пролиферативной активности Ki-67 имеет как теоретическую, так и практическую значимость. Такой подход позволяет комплексно оценить несколько взаимосвязанных компонентов опухолевого фенотипа: активность пролиферации, устойчивость к апоптозу, особенности межклеточной адгезии и возможное участие в этом тирозинкиназных сигнальных путей [1, 6, 10, 12]. Выявление ассоциаций между экспрессией этих маркеров и уровнем Ki-67 поспособствует более точной биологической характеристике карциноидов легкого, уточнению их внутригрупповой гетерогенности и обнаружению дополнительных иммуногистохимических критериев, потенциально значимых для прогностической стратификации [3, 5, 11]

Цель настоящего исследования – иммуногистохимическая оценка синтеза белков ROS1, CEA и BCL2 в НЭО легкого с анализом их распределения в зависимости от индекса пролиферативной активности Ki-67.

Материал и методы

В работу забрано 14 образцов биопсийного материала, полученных от пациентов, проходивших лечение на базе централизованного патологоанатомического отделения Клинической больницы № 1 АО ГК «МЕДСИ». Средний возраст пациентов составил 67,2 года (диапазон 38–86 лет; медиана 68 лет). В совокупной группе преобладали мужчины: 10 мужчин и 4 женщины (соотношение 2,5:1).

Полученный биопсийный материал, после фиксации в 10% забуференном формалине на протяжении 48 ч, проводили по батарее спиртов и парафинов, с последующей заливкой материала в парафиновые блоки. Блоки микротомировали с получением срезов толщиной 3 мкм. Полученные срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическое исследование на парафиновых срезах выполняли по стандартному протоколу производителя на иммуностейнере Ventana BenchMark ULTRA с антителами к Ki-67 [30–9] (Roche, Швейцария), Chromogranin A [LK2H10] (Roche, Швейцария), Synaptophysin [SP11] (Roche, Швейцария), BCL2 [клон 124] (Roche, Швейцария), CEA (263m-95, Cell Marque, США), ROS1 [sp384] (Roche, Швейцария). Детекция прореагировавших первичных антител осуществлялась с использованием OptiView DAB IHC Detection Kit (06396500001, Ventana Medical System, Roche, Швейцария). Полученные гистологические препараты фотодокументировали с использованием сканера микропрепаратов KFBIO KF-PRO-400 (KFBIO, КНР).

Патоморфологическая диагностика проводилась двумя патологоанатомами (вне зависимости от клинических данных и исходов заболевания) на срезах, окрашенных гематоксилином и эозином, с верификацией по положительной иммуногистохимической реакции клеток опухолевой ткани с антителами к Chromogranin A, Synaptophysin.

Классификация опухолей выполнялась в соответствии с актуальной классификацией Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) нейроэндокринных новообразований легких [14]. Для каждого случая определяли морфологический тип: типичный карциноид, атипичный карциноид, крупноклеточную нейроэндокринную карциному или мелкоклеточный рак легкого.

Для целей анализа распределения иммуногисто­химических маркеров все случаи были дополнительно распределены в 2 укрупненные группы на основании морфологического типа: группа 1 «карциноиды», включающая типичный (n=1) и атипичный карциноиды (n=3); группа 2 «карциномы», включающая крупноклеточные нейроэндокринные карциномы (n=2) и мелкоклеточный рак легкого (n=8). Двухгрупповая схема представляет собой аналитическое укрупнение, а не переклассификацию опухолей. Возрастно-половой состав каждой из групп указан в таблице.

При оценке индекса пролиферативной активности по Ki-67 для каждой опухоли выбирали области максимальной ядерной экспрессии маркера («горячие точки»), где проводили подсчет не менее 500 опухолевых клеток. Индекс Ki 67 рассчитывали как процент опухолевых клеток с положительной ядерной реакцией от общего числа подсчитанных опухолевых клеток и фиксировали как непрерывную величину.

Формальные пороговые значения для бинарного разделения по Ki 67 преднамеренно не использовались, учитывая вариабельность распространенности маркера. Индекс Ki 67 применялся как количественный показатель пролиферативной активности, анализировался отдельно в каждой морфологической подгруппе и включался в статистические модели как непрерывный ковариант.

Помимо Ki 67, для каждого случая оценивали митотический индекс (число митозов на 2 мм²), наличие и распространенность опухолевого некроза, а также степень ядерной атипии. Эти параметры учитывались при верификации морфологического типа в соответствии с классификацией ВОЗ и использовались в дальнейшем для описательного анализа и интерпретации результатов [14].

Оценку распределения маркеров ROS1, CEA, BCL2 рассчитывали как процент опухолевых клеток с положительной иммуногистохимической реакцией от общего числа подсчитанных опухолевых клеток и фиксировали как непрерывную величину в процентах (%). Морфо­метрию проводили в жизнеспособной опухолевой ткани в 5 неперекрывающихся полях зрения при увеличении x200. Поля выбирали систематически-случайным способом. Площадь одного поля зрения составляла 0,134 мм², суммарная анализируемая площадь – 0,67 мм² на случай. В каждом случае оценивали не менее 500 опухолевых клеток. Значением для статистического анализа считали среднее значение по случаю после консолидации данных измерений; отдельные поля зрения не рассматривались как независимые наблюдения.

Статистический анализ проводили с использованием программ IBM SPSS Statistics 26.0 (IBM, США). В качестве описательных статистик использовали показатели медианы (Me), межквартильный интервал (Q1; Q3), для межгрупповых сравнений использовали критерий Манна-Уитни, для поиска корреляций использовали тест ранговой корреляции Спирмена.

Результаты

При анализе гистологических препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином, во всех образцах выявлены неопластические образования, представленные, по результатам иммуногистохимического типирования, Synaptophysin+ и Chromogranin A+ опухолевыми клетками.

В группе 1 (карциноиды) экспрессия ROS1 отсутствовала во всех случаях. Распределение CEA-положительных опухолевых клеток в этой группе было низким и Me=0,00% [0,00; 2,60], для BCL2 медиана также равна 0,00% [0,00; 3,35]. Индекс Ki-67 в группе 1 оставался низким. Медиана составила 10,00% [7,75; 12,50].

В группе 2 (карциномы) медиана экспрессии ROS1 составила 0,4% [0,00; 1,27], для CEA Me=18,45% [0,00; 55,75], а для BCL2 Me=48,70 [7,47; 81,65]. Индекс Ki-67 в группе 2 был значительно выше, чем в группе 1, Me=91,00% [89,25; 96,75] (рис. 1, 2).

При статистическом анализе установлено, что группа 2 (карциномы) характеризовалась существенно более высоким индексом пролиферативной активности Ki-67 по сравнению с группой 1 (карциноиды): медиана 91,00% [89,25; 96,75] против 10,00% [7,75; 12,50],  p=0,0057. Кроме того, в группе 2 была статистически значимо выше экспрессия BCL2: Me=48,70% [7,47; 81,65] против Me=0,00% [0,00; 3,35], p=0,0453. Различия по экспрессии ROS1 и CEA между группами статистической значимости не достигали (p=0,1174 и p=0,1993 соответственно). Внутригрупповой корреляционный анализ не выявил устойчивых статистически значимых взаимосвязей в группе 2, тогда как в группе 1 отмечена положительная корреляция между CEA и BCL2, ограниченная малым числом наблюдений (ρ=1,000; p<0,001). В группе 2 наиболее заметной была умеренная положительная корреляционная связь между CEA и BCL2 (ρ=0,500; p=0,1409), не достигшая уровня статистической значимости.

Обсуждение

Полученные результаты подтверждают, что исследованные НЭО легкого образуют два отчетливо различающихся биологических кластера – карциноиды и нейроэндокринные карциномы высокой степени злокачественности, причем наиболее убедительным разграничивающим признаком оказался индекс Ki-67. В представленном материале медиана Ki-67 составила 10,0% в группе карциноидов и 91,0% в группе карцином, что согласуется с современными представлениями о тесной связи пролиферативной активности с биологической агрессивностью легочных нейроэндокринных новообразований [15, 16]. По данным систематических обзоров и современных морфологических работ, высокий индекс Ki-67 ассоциирован с более неблагоприятным течением и может служить полезным дополнительным инструментом при стратификации таких опухолей.

В действующей классификации ВОЗ (2021) индекс пролиферативной активности по Ki-67 не рассматривается как самостоятельный основной критерий типирования, в отличие от нейроэндокринных неоплазий желудочно-кишечного тракта и поджелудочной железы [1]. Основой диагностики по-прежнему остаются морфо­логические признаки, митотическая активность и наличие некроза, тогда как Ki-67 имеет особенно важное вспомогательное значение в малом биопсийном материале и при разграничении карциноидов и высоко­злокачественных нейроэндокринных карцином [15, 16]. Следовательно, выявленные в настоящем исследовании различия по Ki-67 подтверждают биологическую состоятельность такого разграничения и подчеркивают ценность данного маркера в составе комплексной диагностической панели [15, 18].

Статистически значимое повышение экспрессии BCL2 в группе карцином по сравнению с группой карциноидов также представляется закономерным. По данным опубликованных исследований, гиперэкспрессия BCL2 чаще свойственна высокозлокачественным бронхопульмональным нейроэндокринным новообразованиям, прежде всего мелкоклеточному раку легкого, и отражает антиапоптотический фенотип опухоли [16]. В этом аспекте результаты настоящей работы согласуются с представлением о BCL2 как о потенциально полезном дополнительном иммуногистохимическом маркере, способном усиливать диагностическую панель при дифференциальной диагностике между карциноидами и карциномами, особенно в сложных или ограниченных биопсийных образцах [16].

Напротив, для ROS1 и CEA статистически значимых различий между группами выявлено не было, несмотря на тенденцию к более высоким значениям в группе карцином. Вероятнее всего, это связано с малым объемом выборки и выраженной неоднородностью исследуемого материала. В частности, экспрессия ROS1 в карциноидах отсутствовала, а в карциномах носила низко­уровневый и вариабельный характер, что пока не позволяет рассматривать данный белок как надежный дифференциально-диагностический маркер в пределах нынешнего исследования. Аналогично экспрессия CEA демонстрировала значительный разброс, что снижало статистическую мощность анализа и не позволяло сделать однозначные выводы о его самостоятельной диагностической значимости.

Корреляционный анализ не выявил устойчивых статистически значимых взаимосвязей между большинством исследованных иммуногистохимических параметров в группе карцином. Умеренная положительная связь между CEA и BCL2 не достигала статистической значимости, что, вероятно, указывает на независимость механизмов, определяющих пролиферацию, антиапоптотическую активность и фенотипическую экспрессию отдельных белков в высокозлокачественных НЭО легкого. Выявленная в группе карциноидов сильная положительная корреляция между CEA и BCL2 должна интерпретироваться с большой осторожностью в связи с крайне малым числом наблюдений.

Заключение

Таким образом, наиболее информативными маркерами в исследованной панели оказались Ki-67 и BCL2. Первый уверенно отражал различия в пролиферативной активности между карциноидами и карциномами, тогда как второй, вероятно, был ассоциирован с высокозлокачественным фенотипом. Отсутствие статистически значимых различий по ROS1 и CEA не исключает их вспомогательной роли, однако требует дальнейшей верификации на более крупных и морфологически сбалансированных выборках. Основными ограничениями настоящего исследования являются малый объем выборки, преобладание мелкоклеточного рака в группе карцином и отсутствие сопоставления иммуногисто­химических данных с клиническими исходами, что определяет необходимость последующих исследований в этом направлении.

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ

Емелин Алексей Михайлович (Aleksei M. Emelin) – врач-патологоанатом, Клиническая больница № 1 «МЕДСИ» в Отрадном, АО ГК «МЕДСИ»; научный сотрудник лаборатории морфологии и патологии опорно-двигательного аппарата, НИИМЧ им. акад. А. П. Авцына, ГНЦ РФ ФГБНУ «РНЦХ им. акад. Б. В. Петровского», Москва, Российская Федерация
E-mail: eamar40rn@gmail.com
https://orcid.org/0000-0003-4109-0105

Вдовина Дарья Владимировна (Daria V. Vdovina) – сотрудник, Клиническая больница № 1 «МЕДСИ» в Отрадном, АО ГК «МЕДСИ»; врач-ординатор, ГНЦ РФ ФГБНУ «РНЦХ им. акад. Б. В. Петровского», Москва, Российская Федерация
E-mail: darya.vlvdovina@gmail.com
https://orcid.org/0009-0005-0993-9430

Буллих Артем Владимирович (Artem V. Bullikh) – кандидат медицинских наук, заведующий централизованным патологоанатомическим отделением, Клиническая больница № 1 «МЕДСИ» в Отрадном, АО ГК «МЕДСИ», Москва, Российская Федерация
E-mail: bullich83@mail.ru
https://orcid.org/0000-0002-2843-5650

Литература

1. Pelosi G., Travis W. D. The Ki-67 antigen in the new 2021 World Health Organization classification of lung neuroendocrine neoplasms. Pathologica. 2021; 113 (5): 377–87.
2. Granberg D., Juhlin C. C., Falhammar H., Hedayati E. Lung carcinoids: a comprehensive review for clinicians. Cancers. 2023; 15 (22): 5440.
3. Pelosi G., Massa F., Gatti G., et al. Ki-67 evaluation for clinical decision in metastatic lung carcinoids: a proof of concept. Clin Pathol. 2019; 12: 2632010Х19829259.
4. Naheed S., Holden C., Tanno L., et al. The utility of Ki-67 as a prognostic biomarker in pulmonary neuroendocrine tumours: protocol for a systematic review and meta-analysis. BMJ Open. 2019; 9 (8): e031531.
5. Li A., Dougherty B., Klebe S., Mukherjee S., Rose A. Typical pulmonary carcinoid tumours and the relevance of Ki-67 index: a tertiary centre experience in South Australia. J Oncol. 2023; 3 (1): 1085.
6. Bubendorf L., Büttner R., Al-Dayel F., et al. Testing for ROS1 in non-small cell lung cancer: a review with recommendations. Virchows Arch. 2016; 469 (5): 489–503.
7. Mescam-Mancini L., Lantuéjoul S., Moro-Sibilot D., et al. On the relevance of a testing algorithm for the detection of ROS1-rearranged lung adenocarcinomas. Lung Cancer. 2014; 83 (2): 168–73.
8. Dülger O., Öz B. Comparison of different ROS1 immunohistochemistry clones and consistency with fluorescence in situ hybridization results in non-small cell lung carcinoma. Balkan Med J. 2023; 40 (5): 344–50.
9. Swarts D.R.A., Ramaekers F.C.S., Speel E.J. M. Molecular and cellular biology of neuroendocrine lung tumors: evidence for separate biological entities. Biochim Biophys Acta. 2012; 1826 (2): 255–71.
10. Bishopric G. A. Jr, Ordóñez N. G. Carcinoembryonic antigen in primary carcinoid tumors of the lung. Cancer. 1986; 58 (6): 1316–20.
11. Georgakopoulou V. E., Zygouris E., Damaskos C., et al. Prognostic value of the immunohistochemistry markers CD56, TTF-1, synaptophysin, CEA, EMA and NSE in surgically resected lung carcinoid tumors. Mol Clin Oncol. 2022; 16 (2): 31.
12. Chowdry R.P., Sica G.L., Kim S., et al. Phosphorylated Bcl2 and Mcl1 as prognostic markers in small cell lung cancer. Oncotarget. 2016; 7 (27): 43 474–87.
13. Brambilla E., Negoescu A., Gazzeri S., et al. Apoptosis-related factors p53, Bcl2, and Bax in neuroendocrine lung tumors. Am J Pathol. 1996; 149 (6): 1941–52. PMID: 8952529.
14. WHO Classification of Tumours Editorial Board. Thoracic Tumours. 5th ed. Lyon: International Agency for Research on Cancer, 2021: 632 p. (WHO Classification of Tumours Series; vol. 5). ISBN: 978-92-832-4506-3.
15. Naheed S., Holden C., Tanno L., et al. Utility of KI-67 as a prognostic biomarker in pulmonary neuroendocrine neoplasms: a systematic review and meta-analysis. BMJ Open. 2022; 12 (3): e041961.
16. Rekhtman N. Lung neuroendocrine neoplasms: recent progress and persistent challenges. Mod Pathol. 2022; 35 (suppl 1): 36–50.